L’ultimo studio su cani, gatti e Covid-19 e che cosa rivela

E’ apparso ai primi di dicembre l’ultimo studio italiano sulla suscettibilità di cani e gatti al SARS-CoV-2, su Nature communications (link della fonte alla fine dell’articolo). Ho pensato, invece di riportare un riassunto dei dati come fanno le normali testate giornalistiche, di tradurre lo studio e di riportarlo integralmente, con i link alle fonti originali e i link ai documenti scientifici, lo ritengo un metodo più serio di condividere lo studio. Ecco dunque i risultati, che evidenziano un potenziale contagio in cani e gatti conviventi con persone infette, ma con nessun pericolo di trasmettere il virus agli umani. Ecco dunque lo studio.

Evidenze di esposizione a SARS-CoV-2 nei gatti e cani provenienti da famiglie in Italia

E. I. Patterson, G. Elia, A. Grassi, A. Giordano, C. Desario, M. Medardo, S. L. Smith, E. R. Anderson, T. Prince, G. T. Patterson, E. Lorusso, M. S. Lucente, G. Lanave, S. Lauzi, U. Bonfanti, A. Stranieri, V. Martella, F. Solari Basano, V. R. Barrs, A. D. Radford, U. Agrimi, G. L. Hughes, S. Paltrinieri & N. Decaro

Prefazione
La SARS-CoV-2 è emersa dagli animali e ora è facilmente trasmessa tra le persone. Il rilevamento sporadico di casi negli animali insieme al successo di infezioni sperimentali di animali domestici, come gatti, furetti e cani, solleva interrogativi sulla suscettibilità degli animali domestici in condizioni normali. Riportiamo uno studio su larga scala per valutare l’infezione da SARS-CoV-2 in 919 animali da compagnia che vivono nel nord Italia, campionati in un momento in cui l’infezione umana era frequente. Nessun animale è risultato positivo alla PCR. Tuttavia, il 3,3% dei cani e il 5,8% dei gatti avevano titoli anticorpali neutralizzanti SARS-CoV-2 misurabili, con cani provenienti da famiglie positive per COVID-19 che avevano una probabilità significativamente maggiore di risultare positivi rispetto a quelli provenienti da famiglie negative per COVID-19. Comprendere i fattori di rischio associati a questo e il loro potenziale di infettare altre specie richiede un’indagine urgente.

Introduzione

Casi di infezione da coronavirus 2 (SARS-CoV-2) da sindrome respiratoria acuta grave sono stati rilevati alla fine di dicembre 2019 a Wuhan, nella provincia di Hubei, Cina, probabilmente come un salto di specie dai pipistrelli all’uomo, e si sono rapidamente diffusi in tutto il mondo diventando una pandemia. Sebbene si ritenga che il virus si diffonda quasi esclusivamente attraverso la trasmissione da uomo a uomo, si teme che alcune specie animali possano contribuire alla pandemia di SARS-CoV-2 in corso. Ad oggi, sono stati segnalati casi sporadici di infezione da SARS-CoV-2 in cani e gatti.

Questi includono il rilevamento dell’RNA SARS-CoV-2 in campioni respiratori e / o fecali di cani e gatti con o senza segni clinici, nonché di anticorpi specifici nel siero di animali domestici affetti dalla malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). Inoltre, l’infezione sperimentale di varie specie animali ha dimostrato che, sebbene i cani appaiano scarsamente suscettibili all’infezione da SARS-CoV-2, sviluppando infezioni asintomatiche ed eliminando virus a basso titolo o nessun virus, i gatti sviluppano patologie respiratorie e perdono titoli elevati di SARS-CoV-2 , e sono in grado di infettare animali a contatto con loro. Sono necessari test su larga scala delle specie sensibili per valutare l’entità dell’infezione animale in condizioni di allevamento più naturali. Qui abbiamo condotto una vasta indagine epidemiologica da marzo a maggio 2020 in cani e gatti che vivono in Italia, in famiglie SARS-CoV-2-positive o che vivono in aree geografiche gravemente colpite da COVID-19. Da quel che sappiamo, questo è il più grande studio per indagare sulla SARS-CoV-2 negli animali da compagnia fino ad oggi.

Risultati

Tutti gli animali sono stati campionati dal loro veterinario privato durante le visite mediche di routine tra il 15 marzo e l’11 maggio 2020. Il campionamento degli animali per questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università di Bari, Italia (numero di approvazione 15/2020). Sono stati campionati un totale di 603 cani e 316 gatti provenienti da diverse regioni italiane, principalmente Lombardia (476 cani, 187 gatti).

Gli animali sono stati campionati da regioni gravemente colpite da epidemie di COVID-19 nell’uomo o da quelle che offrivano un comodo accesso ai campioni. Sono stati raccolti tamponi orofaringei (303 cani, 173 gatti), nasali (183 cani, 78 gatti) e / o rettali (66 cani, 30 gatti) da un totale di 494 animali domestici utilizzando tamponi in fibra sintetica (Tabella 1).

Per 340 cani e 188 gatti, sono stati raccolti segnali completi e anamnesi clinica, inclusi razza, sesso, età, esposizione a esseri umani infetti da COVID-19 nelle 2 settimane precedenti (nucleo familiare positivo per COVID-19, nucleo familiare sospetto ma non confermato da un test specifico e da COVID-19 negativo) e dalla presenza di segni respiratori (tosse, starnuti, congiuntivite, secrezione nasale e / o oculare). Gli animali domestici che vivono con pazienti infetti da SARS-CoV-2 includevano 47 cani e 22 gatti per la sierologia e 64 cani e 57 gatti per le indagini molecolari, con un singolo animale campionato da ciascuna famiglia positiva per COVID-19.

I sieri erano disponibili per 188 cani e 63 gatti per i quali erano disponibili informazioni complete, la storia e la posizione (Fig. 1). Sieri aggiuntivi sono stati raccolti dai laboratori diagnostici per 263 cani e 128 gatti dalle aree colpite, ma per i quali mancavano ulteriori informazioni storiche.

Per il rilevamento dell’RNA di SARS-CoV-2 sono stati utilizzati due test di PCR a trascrizione inversa in tempo reale (RT-PCR) mirati ai geni delle nucleoproteine ​​e delle proteine ​​dell’involucro. I test di neutralizzazione della riduzione della placca (PRNT) sono stati eseguiti con SARS-CoV-2 / umano / Liverpool / REMRQ0001 / 2020 isolato. PRNT80 è stato determinato dalla diluizione più elevata con una riduzione ≥80% delle placche rispetto al controllo.

Tutti i 494 animali da cui era disponibile almeno un tampone sono risultati negativi per SARS-CoV-2 RNA, inclusi 38 gatti e 38 cani che presentavano malattie respiratorie al momento del campionamento, suggerendo l’assenza di infezione attiva di SARS-CoV-2 nel animali testati. Inoltre, 64 di questi cani e 57 dei gatti risultati negativi al test vivevano in famiglie precedentemente confermate come affette da COVID-19 e 14 animali (11 gatti e 3 cani) provenienti da famiglie COVID-19 mostravano segni respiratori al momento del campionamento.

Anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 sono stati rilevati in 15 cani (3,3%, 15/451) e 11 gatti (5,8%, 11/191), con titoli compresi tra 1:20 e 1: 160 e da 1:20 a 1: 1280 rispettivamente nei cani e nei gatti. Dei campioni provenienti da famiglie con stato COVID-19 noto, gli anticorpi neutralizzanti sono stati rilevati in 6 cani su 47 (12,8%) e 1 gatto su 22 (4,5%) da famiglie positive a COVID-19, 1 cane su 7 (14,3%) e 0 gatti su 3 (0%) da famiglie sospette positive per COVID-19 e 2 gatti su 133 (1,5%) e 1 gatti su 38 (2,6%) da famiglie negative per COVID-19 (Tabella 2). Per quei 423 animali in cui è stata registrata un’età, 0 su 30 di età inferiore a 1 anno (0,0%), 6 su 92 di età compresa tra 1 e 3 anni (6,5%), 3 su 102 di età compresa tra 4 e 7 anni (2,9%) e 6 su 199 di età pari o superiore a 8 anni (3,0%) è risultato positivo. Nessuno degli animali con anticorpi neutralizzanti mostrava segni respiratori al momento del campionamento.

Sieri di riferimento o fluidi ascitici di animali precedentemente risultati positivi per coronavirus enterico canino(tre sieri), coronavirus respiratorio canino (tre sieri) e coronavirus felino (tre fluidi ascitici) sono risultati negativi al test PRNT per SARS-CoV-2, confermando la specificità dei risultati ottenuti.

I cani avevano una probabilità significativamente maggiore di risultare positivi agli anticorpi neutralizzanti la SARS-CoV-2 se provenivano da una famiglia nota positiva per COVID-19 (test esatto di Fisher, p = 0,004) o erano maschi (test esatto di Fisher, p = 0,045) , mentre non c’erano dati sufficienti per valutare una correlazione con lo stato di neutralità, poiché questo è stato segnalato solo per 1 cagna sieropositiva. Per le province della regione Lombardia dove erano disponibili almeno dieci campioni, c’era un trend positivo tra la proporzione di cani risultati positivi e il carico registrato di malattia umana (r di Spearman = 0,771, p = 0,103) (Fig.2) ( Fonte dei dati S2). Un’associazione simile è stata osservata per i gatti (r = 0,696 di Spearman, p = 0,125).

Discussione

In seguito alla sua probabile trasmissione originale agli esseri umani dagli animali, SARS-CoV-2 si è diffuso a livello globale all’interno della popolazione umana con effetti devastanti sulla salute e sull’economia. Ad oggi, SARS-CoV-2 è stato rilevato sporadicamente in cani e gatti infetti naturalmente, la maggior parte dei quali viveva a stretto contatto con esseri umani infetti. La maggior parte degli studi sugli animali da compagnia sono di piccola natura, probabilmente a causa di un’inevitabile attenzione alla ricerca sulle malattie umane. I nostri risultati di questo ampio studio sull’infezione da SARS-CoV-2 in animali di proprietà che vivono in aree in cui la trasmissione virale era attiva nella popolazione umana confermano le osservazioni sul campo che sia cani che gatti possono sieroconvertiti nelle normali condizioni di proprietà di animali domestici.

Il legame tra l’infezione domestica da SARS-CoV-2 e la sieropositività di un animale domestico era evidente solo per i cani, suggerendo forse una maggiore interazione tra le persone positive e i loro cani domestici rispetto ai gatti. Ciò contrasta gli studi sperimentali in cui i cani erano meno suscettibili alle infezioni. Tuttavia, questo risultato potrebbe anche riflettere il piccolo numero di gatti sieropositivi identificati. Inoltre, una percentuale maggiore di cani maschi era sieropositiva rispetto alle femmine, ma anche in questo caso i risultati avrebbero potuto essere influenzati dalle piccole dimensioni degli animali positivi. In effetti, lo stato di neutralità era sconosciuto per la maggior parte degli animali sieropositivi, il che ha impedito un confronto completo con la situazione nell’uomo. Studi futuri sugli animali e sull’uomo dovrebbero indagare se questo fenomeno si basa su differenze fisiologiche o comportamentali tra maschi e femmine.

Sebbene vi siano chiare differenze di genere nei risultati nelle infezioni umane da COVID-19, con i maschi a più alto rischio di malattia grave, non sembra esserci alcuna prova di una differenza nel rischio di infezione. Nessuno dei 30 animali giovani, di età <1 anno, è risultato positivo. I nostri risultati sono coerenti con le segnalazioni di altri cani e gatti esposti naturalmente sieropositivi, che erano tutti adulti, e di cani e gatti adulti infettati sperimentalmente in cui i segni clinici non erano visualizzati. Tuttavia, nei gatti di età inferiore a 1 anno è stata osservata una maggiore suscettibilità all’infezione da SARS-CoV-2 a 70-100 giorni rispetto a 8 mesi di età.

Contrariamente ai risultati sierologici, tutti gli animali sono risultati negativi alla PCR, compresi gli animali che vivono in famiglie con infezione umana da COVID-19 confermata e quelli con e senza segni respiratori. Ciò suggerisce che sebbene gli animali da compagnia possano essere sieroconvertiti, possono trasmettere il virus per periodi di tempo relativamente brevi. In studi sperimentali, i gatti hanno interrotto la diffusione del virus entro 10 giorni dall’infezione (dpi) e hanno sviluppato risposte anticorpali neutralizzanti di 7-13 dpi. Risultati simili sono stati riportati in infezioni sperimentali di cani, in cui il virus è stato rilevato nelle feci fino a 6 dpi, ma non nei tamponi orofaringe6. Tuttavia, in un cane Pomerania con infezione naturale, l’RNA di SARS-CoV-2 è stato rilevato da tamponi nasali mediante RT-PCR quantitativa per almeno 13 giorni a basso titolo, mentre il virus non è stato rilevato in campioni fecali / rettali, suggerendo che la diffusione del virus i modelli possono variare in alcuni animali. La metà dei cani testati aveva anticorpi rilevabili a 14 dpi. Questi studi e il nostro evidenziano risultati simili nel rilevamento dell’infezione da SARS-CoV-2 che esistono sia per gli esseri umani che per gli animali. Con il nostro set di dati sul campo non è possibile stimare il tempo di infezione negli animali che erano sieropositivi e le restrizioni sui movimenti umani e animali durante la pandemia potrebbero aver ritardato le visite ai medici veterinari dove si è verificato il campionamento. Sosteniamo l’inclusione degli animali domestici nelle valutazioni in corso della muta della comunità e delle famiglie per migliorare il rilevamento dell’infezione attiva.

In questa vasta indagine epidemiologica su SARS-CoV-2, abbiamo scoperto che gli animali da compagnia che vivono in aree ad alta infezione umana sono stati esposti a SARS-CoV-2, confermando così precedenti segnalazioni di infezioni naturali di cani e gatti con il nuovo coronavirus. I nostri risultati suggeriscono che i cani meritino ulteriori indagini sulla suscettibilità alla SARS-CoV-2, sebbene siano stati rilevati titoli anticorpali più elevati nei gatti, il che è in accordo con studi precedenti, suggerendo che questi animali sono più suscettibili all’infezione da SARS-CoV-29,18. Abbiamo anche osservato tassi di sieropositività negli animali paragonabili a quelli degli esseri umani attraverso il campionamento comunitario in un momento simile nei paesi europei20,21,22. Ciò suggerisce che l’infezione negli animali da compagnia non è insolita. Sulla base delle attuali conoscenze, è improbabile che gli animali domestici infetti svolgano un ruolo attivo nella trasmissione della SARS-CoV-2 all’uomo. Tuttavia, la trasmissione da animale a uomo può essere più probabile in determinate condizioni ambientali, come l’elevata densità di popolazione animale riscontrata negli allevamenti di visoni infetti. Man mano che la trasmissione umana diventa più rara e il tracciamento dei contatti diventa più accessibile, si può consigliare la sorveglianza sierologica degli animali domestici per sviluppare un quadro olistico delle dinamiche della malattia della comunità e garantire che tutte le opportunità di trasmissione siano terminate.

Metodi

Campioni

Tutti gli animali sono stati campionati dal loro veterinario privato durante una visita medica per altri motivi. Sono stati campionati un totale di 603 cani e 316 gatti provenienti da diverse regioni italiane, principalmente Lombardia (476 cani, 187 gatti). Gli animali sono stati campionati da regioni gravemente colpite da epidemie di COVID-19 nell’uomo o da quelle che offrivano un comodo accesso ai campioni. Sono stati raccolti tamponi orofaringei (303 cani, 173 gatti), nasali (183 cani, 78 gatti) e / o rettali (66 cani, 30 gatti) da un totale di 494 animali domestici utilizzando tamponi in fibra sintetica (Tabella 1). I tamponi orofaringei sono stati raccolti inserendo il tampone nelle aree posteriori della faringe e delle tonsille. Per la raccolta delle secrezioni nasali, lo stesso tampone è stato inserito in ciascuna narice e ruotato in modo da essere saturato dal liquido nasale. I tamponi rettali sono stati raccolti inserendo il tampone 1–2 cm oltre il margine anale e ruotando delicatamente il tampone di 360 °. Dopo il tampone, ciascun tampone è stato immerso in 1,5 ml di mezzo di trasporto virale.

Per 340 cani e 188 gatti, erano disponibili informazioni complete e anamnesi clinica, inclusi razza, sesso, età, esposizione a esseri umani con infezione da COVID-19 (famiglia positiva per COVID-19, famiglia sospetta positiva per COVID-19 ma non confermata da test e COVID-19 negativo), la presenza di segni respiratori (tosse, starnuti, congiuntivite, secrezione nasale e / o oculare).

I sieri erano disponibili per 188 cani e 63 gatti per i quali erano disponibili il tracciamenti completo, la storia e la posizione (Fig. 1). Sieri aggiuntivi sono stati raccolti dai laboratori diagnostici per 263 cani e 128 gatti dalle aree colpite, ma per i quali mancavano ulteriori informazioni storiche.

Il campionamento degli animali per questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università di Bari, Italia (numero di approvazione 15/2020).

Reazione a catena della polimerasi

La preparazione del campione e l’estrazione dell’RNA sono state effettuate nel laboratorio di contenimento di livello 3 di biosicurezza presso il Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università di Bari, Italia. Il rilevamento dell’RNA di SARS-CoV-2 ha utilizzato due test RT-PCR in tempo reale mirati ai geni delle nucleoproteine ​​e delle proteine ​​dell’involucro. In breve, è stato adottato un metodo a una fase utilizzando il sistema RT-PCR in una fase Superscript III con Platinum Taq Polymerase (Invitrogen srl, Milano, Italia) e la seguente miscela da 50 µl: 25 µl di master mix, 400 nM (E_Sarbeco_F , E_Sarbeco_R), 600 nM (N_Sarbeco_F) o 800 nM (N_Sarbeco_R) di primer, 200 nM di sonde (E_Sarbeco_P1 o N_Sarbeco_P) (Tabella supplementare 1) e 10 μl di stampo RNA. Il profilo termico consisteva nell’incubazione a 55 ° C per 10 min per la trascrizione inversa, seguita da 95 ° C per 3 min e quindi da 45 cicli a 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 30 s.

Test di neutralizzazione della riduzione della placca

L’isolato SARS-CoV-2 / umano / Liverpool / REMRQ0001 / 2020 è stato coltivato in cellule Vero E613. Per PRNT12, i sieri sono stati inattivati ​​termicamente a 56 ° C per 1 ora e conservati a -20 ° C fino all’uso. Il terreno essenziale minimo di Dulbecco contenente il 2% di siero bovino fetale e 0,05 mg / mL di gentamicina è stato utilizzato per due diluizioni seriali di siero. SARS-CoV-2 a 800 PFU / mL è stato aggiunto a un volume uguale di siero diluito e incubato a 37 ° C per 1 ora. La diluizione del siero virale è stata inoculata su cellule Vero E6, incubata a 37 ° C per 1 ora e sovrapposta come nei saggi di placca standard. Le cellule sono state incubate per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO2, quindi fissate con formalina al 10% e colorate con una soluzione di violetto cristallino allo 0,05%. PRNT80 è stato determinato dalla diluizione più elevata con una riduzione dell’80% delle placche rispetto al controllo. I campioni con titolo anticorpale neutralizzante rilevabile sono stati ripetuti come replicati tecnici per la conferma.

Analisi dei dati

Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per analizzare le differenze nel rilevamento di anticorpi da famiglie con stato di infezione noto da COVID-19 e il rilevamento di anticorpi da animali maschi e femmine. La correlazione di Spearman è stata utilizzata per analizzare la relazione tra i numeri di casi COVID-19 umani e il rilevamento di anticorpi negli animali. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite in GraphPad Prism 6.

Riepilogo dei rapporti

Ulteriori informazioni sulla progettazione della ricerca sono disponibili nel sommario dei rapporti sulla ricerca sulla natura collegato a questo articolo. (vedi link alla fonte in fondo a questo testo).

Disponibilità dei dati

Gli autori dichiarano che i dati a sostegno dei risultati di questo studio sono disponibili all’interno dell’articolo e dei suoi file di informazioni supplementari, o sono disponibili presso gli autori su richiesta. I dati di origine sono forniti con questo documento.

Ringraziamenti

Gli estratti di SARS-CoV-2 RNA da pazienti umani infetti che sono stati utilizzati come controlli positivi nei test RT-PCR in tempo reale sono stati gentilmente forniti dall’Istituto Zooprofilattico della Puglia e della Basilicata, Foggia, e dall’Istituto Zooprofilattico dell’Abruzzo e del Molise “G. Caporale ”, Teramo, Italia. Siamo grati ai veterinari che hanno contribuito alla raccolta dei campioni nelle regioni italiane gravemente colpite da COVID-19. Questo lavoro è stato sostenuto dai contributi della Fondazione CARIPLO-Misura a sostegno dello sviluppo di collaborazioni per l’identificazione di terapie e sistemi di diagnostica, protezione e analisi per contrasto l’emergenza Coronavirus e altre emergenze virali del futuro, progetto “Caratterizzazione genetica della SARS -CoV2 e indagine sierologica su esseri umani e animali domestici per definire il ruolo di cani e gatti nella pandemia COVID-19 (COVIDinPET) ”. E.I.P. è stato sostenuto dal premio Catalyst Fund del direttore della Liverpool School of Tropical Medicine. S.L.S. e A.D.R. sono stati supportati da DogsTrust. G.L.H. è stato supportato da BBSRC (BB / T001240 / 1), Royal Society Wolfson Fellowship (RSWF \ R1 \ 180013), sovvenzioni NIH (R21AI138074 e R21AI129507), UKRI (20197) e NIHR (NIHR2000907). G.L.H. e T.P. sono affiliate al National Institute for Health Research Health Protection Research Unit (NIHR HPRU) in infezioni emergenti e zoonotiche presso l’Università di Liverpool in collaborazione con Public Health England (PHE), in collaborazione con la Liverpool School of Tropical Medicine, l’Università di Oxford, e l’Università di Liverpool. G.L.H. ha sede presso LSTM. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle del NHS, del NIHR, del Department of Health o Public Health England. Gli autori sono grati a tutti i medici veterinari che hanno contribuito alla raccolta dei campioni.

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Fonte originale in inglese dello studio su Nature Communications

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